표적을 통해 생성된 리포터 단백질을 통해 상온에서 바이러스 RNA 검출

Nature Biomedical Engineering (2023)이 기사 인용

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측정항목 세부정보

핵산 분석은 반응 온도 제어 및 신호 감지를 위해 값비싸고 정교한 장비가 필요하기 때문에 일반적으로 현장 진료 환경에 배포할 수 없습니다. 여기서 우리는 주변 온도에서 핵산의 정확하고 다중화된 검출을 위한 기기 없는 분석을 보고합니다. 우리가 INSPECTR(내부 부목 쌍 발현 카세트 번역 반응용)라고 명명한 이 분석은 DNA 프로브의 표적 특이적 부목 결찰을 활용하여 리포터 단백질의 무세포 합성을 위해 유연하게 설계할 수 있는 발현 카세트를 생성합니다. 4배 규모의 선형 검출 범위를 허용하는 효소 리포터와 고도로 다중화된 시각적 검출을 가능하게 하는 펩타이드 리포터(고유한 표적에 매핑될 수 있음)를 제공합니다. 우리는 INSPECTR를 사용하여 측면 흐름 판독을 통해 단일 반응에서 5개의 호흡기 바이러스 표적 패널을 검출하고 발현 카세트의 추가 주변 온도 롤링 서클 증폭을 통해 바이러스 RNA의 ~4,000개 사본을 검출했습니다. 합성 생물학을 활용하여 핵산 진단을 위한 작업 흐름을 단순화하면 진료 시점에 더 폭넓게 적용할 수 있습니다.

현재 진행 중인 코로나19 팬데믹은 치료 시점과 필요 시점에서 병원체를 저렴한 비용으로 탐지할 수 있는 새롭고 혁신적인 진단 기술에 대한 긴급한 요구 사항을 강조합니다1. 신속 항원 테스트는 사용 용이성, 저렴한 비용 및 실온 보관으로 인해 전 세계 주문형 테스트를 지배하고 있습니다2. 그러나 이러한 테스트를 제조하는 데 필요한 항원 특이적 항체를 식별하는 것은 까다롭고 시간 집약적이므로 병원체 균주 및 변이체를 다중화하거나 구별하는 항원 테스트 기능이 제한됩니다. 바이러스 또는 박테리아 핵산을 검출하는 분자 분석은 더 빠른 개발 주기, 더 나은 변종 식별, 더 높은 민감도 및 우수한 검출 한계(LoD)3를 위해 신속한 항원 테스트보다 선호됩니다. 그럼에도 불구하고 이러한 분석의 최적 표준인 qPCR(정량적 중합효소 연쇄 반응)은 온도 순환을 제어하고 특정 표적 서열의 증폭을 감지하기 위한 정교한 장비가 필요하며 필요한 시점에 배포하기가 어렵습니다4. 기기가 필요 없는 분석 및 검출 방법은 소비자, 특히 중앙 집중식 테스트 실험실에 접근할 수 없는 사람들에 대한 민감한 분자 테스트의 접근성을 극적으로 향상시킬 수 있습니다5.

qPCR의 정확한 주기적 가열 요구 사항은 LAMP(루프 매개 증폭)6, RPA(재조합 중합효소 증폭)7,8 및 NEAR(닉킹 효소 증폭 반응)9과 같은 등온 핵산 증폭 전략에 의해 해결되었습니다. 이러한 전략 중 다수는 형광 프로브(예: RPA) 또는 분자 비컨(예: NEAR)을 사용하는 검출 단계에 증폭을 결합하여 추가적인 특이성을 제공합니다. SHERLOCK 또는 DETECTR과 같은 다른 방법은 CRISPR 기술을 활용하여 프로그래밍 가능한 뉴클레아제 Cas12 또는 Cas13의 부수적 활성을 사용하여 소멸된 형광단의 방출을 통해 증폭을 감지합니다(참조 10,11,12,13,14,15,16, 17). 그러나 이러한 등온 전략에는 여전히 장비가 필요합니다. 즉, 지수 증폭 중에 효소 활동을 위한 최적의 온도를 달성하고 유지하기 위한 휴대용 히터와 형광을 측정하기 위한 광도계가 필요합니다. 더욱이, 이러한 등온 증폭 기술은 프라이머 디자인의 어려움과 형광 리포터의 방출 스펙트럼의 중첩으로 인해 다중화 능력이 제한되어 있습니다.

대조적으로, 합성 생물학 전략은 보다 유연한 단백질 기반 판독을 통해 핵산 검출을 가능하게 합니다. 유전자 발현은 발판 스위치와 같은 서열 특이적 리보조절인자를 사용하여 제어될 수 있으며, 이로써 표적(또는 '트리거') RNA 서열만이 신호를 전달하여 단백질 리포터 생산을 활성화할 수 있습니다. 이러한 리포터는 형광성, 비색성 또는 발광성일 수 있으므로 다양한 검출 모드가 가능합니다. 특히 Toehold 스위치는 자원이 부족한 환경에서 체외 분자 진단을 위해 배포되었습니다19. 병원체 유래 표적 서열은 종종 사전 증폭 후 동결건조 CFE(무세포 발현) 반응20에 직접 추가되어 Ebola20, Zika21, norovirus22, C. difficile23, HIV24 및 SARS를 상온에서 안정적이고 민감하게 검출할 수 있습니다. -CoV-2(참조 25) 서열. 이러한 무세포 발현 반응은 주변 조건에 가까운 조건에서 실행될 수 있지만 필수 사전 증폭은 종종 장비가 여전히 필요하다는 것을 의미합니다.