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Scientific Reports 13권, 기사 번호: 4588(2023) 이 기사 인용

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일상적인 폐렴구균 접합 백신(PCV) 예방접종의 직간접적인 영향을 자세히 평가하려면 동시 집락화 폐렴구균 혈청형을 검출하기 위한 민감한 도구가 필요합니다. 보관된 임상 샘플에서 92개의 폐렴구균 혈청형을 검출하고 정량화하기 위해 처리량이 높은 정량적 나노유체 실시간 PCR(Standard BioTools 'Fluidigm') 반응 세트가 개발되었습니다. 2009~2011년에 남아프리카공화국의 5세 이하 어린이로부터 수집한 비인두 면봉 표본을 비교를 위해 사용했으며, 이전에 표준 배양 기반 방법으로 혈청형을 분석했습니다. 'Fluidigm' 내의 반응 세트는 높은 효율(90-110%), 재현성(R2 ≥ 0.98) 및 낮은 검출 한계(< 102 CFU/ml)로 모든 표적을 효과적으로 증폭시켰습니다. 1,973개의 비인두 면봉 샘플을 맹검 분석한 결과 참조 표준인 배양 기반 Quellung 방법과 비교하여 진단 민감도 > 80% 및 특이도 > 95%를 나타냈습니다. qPCR 방법은 Quellung(ROC-AUC: > 0.73)에 비해 좋은 차별성을 가지고 폐렴구균 유형의 혈청형을 분류할 수 있었습니다. 처리량이 높은 나노유체 실시간 PCR 방법은 단일 qPCR 실행 내에서 96개 샘플(대조군 포함)의 16개 혈청군 내의 57개 개별 혈청형과 35개 혈청형을 동시에 검출합니다. 이 방법은 동시에 집락화되는 여러 혈청형의 검출을 포함하여 백신 혈청형 및 비백신 혈청형 집락화에 대한 현재 PCV 제제의 영향을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 당사의 qPCR 방법을 사용하면 혈청형별 세균 부하를 모니터링할 수 있을 뿐만 아니라 침습성 질병 가능성이 있을 수 있는 소수 또는 공동 집락 혈청형의 출현 또는 진행 중인 전파를 모니터링할 수 있습니다.

폐렴연쇄상구균의 캡슐은 혈청형 이질성을 부여하는 CPS(피막 다당류 합성) 유전자좌에 의해 유전적으로 암호화된 반복 다당류로 구성됩니다1,2. 생화학적, 혈청학적으로 구별되는 S. pneumoniae 혈청형은 100가지가 있습니다3. 피막의 다양성은 S. pneumoniae4의 중요한 병독성 요소이며 혈청형은 인간에게 질병을 일으킬 가능성이 다릅니다5. 폐렴구균 접합 백신(PCV)은 질병의 전조인 폐렴구균 백신 혈청형(VT) 보균자의 획득을 예방합니다6,7,8,9,10. 최초로 허가된 PCV(PCV7)는 7가지 혈청형, 즉 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F를 표적으로 삼았습니다. 현재 우리 환경에서 사용되는 PCV에는 추가로 3가지(PCV10: 1, 5 및 7F)와 6가지(PCV13: 1, 3, 5, 6A, 7F 및 19A) 혈청형이 포함됩니다. 차세대 15가 및 20가 PCV는 임상 시험 중이며 PCV13과 비교하여 추가로 각각 2개(22F 및 33F)11 및 7개(8, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F 및 33F)12 혈청형을 포함합니다.

상기도의 폐렴구균 집락화를 감시하는 것은 인구 수준에서 PCV 예방접종의 영향을 평가하는 데 유용합니다13. 폐렴구균 집락화 조사는 VT 및 비백신 혈청형(NVT)을 포함한 여러 혈청형 공동 보균자를 검출할 수 있는 포괄적이고 민감하며 정확한 혈청형 분석 방법을 사용하여 가장 잘 수행됩니다. 다양한 지리적 지역에 맞춘 것을 포함하여 더 높거나 대체 원자가의 PCV의 백신 접종 전략과 활용을 알리기 위해서는 순환하는 혈청형에 대한 일관된 감시가 필요합니다. 신흥 또는 대체 혈청형을 검출하는 데 사용됩니다13.

배양 기반 Quellung 방법은 S. pneumoniae 혈청형 분석의 표준으로 남아 있습니다. 그러나 이러한 방법은 시간이 많이 걸리고 감도가 낮으며 비용이 많이 듭니다14,15. 배양 기반 방법과 비교하여 중합효소연쇄반응(PCR) 기반 검출 및 혈청형 분석은 항생제 사용, 검체 운반 및 보관 조건에 의해 부정적인 영향을 받을 수 있는 유기체 생존 능력에 의존하지 않으며 시간 소모가 적고 빠른 진단과 더 높은 감도를 제공합니다15 . 겔 또는 모세관 전기영동을 사용하고 도트 블롯 검출, 배양 농축 및 시퀀싱 기반 분석과 결합된 단일 튜브 중첩 및 다중 PCR을 포함하여 기존 및 실시간 PCR이 사용되었습니다16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28. 실시간 PCR 방법은 처리량이 많은 시스템을 포함하여 검출된 혈청형의 수가 증가하면서 개발되었습니다. 또한 박테리아 부하29,31,32,34를 결정하기 위해 검증된 정량적 PCR(qPCR) 방법은 공중 보건 프로그램에서 백신의 영향을 평가하는 데 중요합니다. 비인두의 세균 부하 증가는 혈청형별 침습성 질환 가능성을 예측할 수 있습니다31.

0.98, Table 1), allowing for relative quantification of bacterial load using the slope of the linear equation. The linear dynamic range for these assay-sets was at least 5-log fold. Further, Levy-Jennings plots constructed using assay-set specific reference calibrators were within ± 2.0 SD of the mean Cq value across all plates. This validated the use of the designed calibrators (gBlocks). The assay-sets for the detection of E. coli, Pneumocystis jiroveci, S. algalactiae, the Xisco gene of S. pneumoniae and the Bacterial 16S ribosomal RNA gene (listed in Supplementary Table S1) did not perform well within this reaction-set, as the efficiency was < 90% or > 110% or r2 < 0.98 (Supplementary Table S5)./p> 80% sensitivity (Table 3) in the 1 973 archived clinical samples for 36 assay-sets. The diagnostic sensitivity for six assay-sets (1; 7B/C/40; 23A; 29; 33B and 35A/C/42) was lower (50–74%, Table 3) as the prevalence of the targeted serotypes detected by Quellung was ≤ 1% whereas additional targeted serotypes were detected using ‘Fluidigm’ qPCR (Fig. 3). The remaining assay-sets could not be assessed as explained above. The diagnostic specificity was high (> 95%) for all assay-sets where targeted serotypes were previously detected by Quellung (Table 3)./p> 0.05; Table 3). The ‘Fluidigm’ reaction-set was able to identify an additional 39.1% (826/2113) serotypes above those detected by culture for the compared assay-sets in Table 3, and conversely culture detected 132 (9.3% of 1419) serotypes not identified by ‘Fluidigm’ qPCR (Table 3, Fig. 3)./p> 0.98). Notably, the detection of additional serotypes (39.1%) by the ‘Fluidigm’ qPCR panel described here with 96 assay sets, is comparable to the ‘Fluidigm’ panel described previously (also 39.1%), that included 48 assay sets32. Compared with the gold-standard culture based-Quellung method, our reaction-set was 98.8% accurate for the classification of pneumococcal serotypes. Further, the average sensitivity across the qPCR reaction-set was 89.1% compared with Quellung./p>

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